จน พ.ศ. 2436

จึงได้เสด็จเข้ารับราชการในตำแหน่ง นายเวรกระทรวงธรรมการ ขณะพระชันษา 16 ปี 3 เดือน ทรงเลื่อนขึ้นเป็นผู้ช่วยในกรมศึกษาธิการใน พ.ศ. 2438 ทั้งได้ทรงรับหน้าที่พิเศษเป็นข้าหลวงสอบไล่วิชาหนังสือไทยและ ทรงเป็นกรรมการพิเศษร่างพระราชบัญญัติพิจารณาความแพ่งอีกหน้าที่หนึ่ง

ขณะที่ทรงรับราชการอยู่ในกระทรวงธรรมการ 2 ปี เศษนั้น ทรงสนพระทัยที่จะแสวงหาความรู้ทางภาษาอังกฤษเพิ่มเติมอยู่มิได้ขาด โดยทรงกระทำพระองค์สนิทชิดชอบกับที่ปรึกษากระทรวง และข้าราชการอื่นๆ ที่เป็นชาวอังกฤษ ทั้งในเวลาราชการและนอกเวลาราชการ อาทิ การไปเล่นกอล์ฟหรือฮ๊อคกี้ตามท้องสนามหลวง เสด็จไปเล่นเทนนิสตามบ้านฝรั่งหรือตามคลับ เป็นสมาชิกในคลับเรือใบซึ่งตั้งอยู่ถึงแถบชายทะเลจังหวัดสมุทรปราการ ซึ่งความพยายามเหล่านี้ล้วนเป็นเครื่องเพิ่มพูนความรู้ทางภาษาอังกฤษเป็นอย่างดี ดังนั้น พระองค์จึงทรงคุ้นกับขนบธรรมเนียมและตรัสภาษาอังกฤษได้อย่างคล่องแคล่ว

ด้วยเหตุนี้ จึงมีพระบรมราชโองการโปรดเกล้าฯให้ย้าย พระองค์เจ้ารัชนี มร เป็นผู้ช่วยที่ปรึกษากระทรวงพระคลังมหาสมบัติ

วันที่ 15 มกราคม พ.ศ. 2442

เสด็จเข้ารับราชการในตำแหน่งผู้ช่วยกรมตรวจและกรมสารบัญชี กระทรวงพระคลังมหาสมบัติ และในวันที่ 1 เมษายน พ.ศ. 2444 ได้ทรงย้ายไป ดำรงตำแหน่งปลัดกรมธนบัตร ซึ่งเป็นเวลา ที่กระทรวงพระคลังมหาสมบัติ เริ่มที่จะจัดพิมพ์ธนบัตรออกใช้แทนเหรียญตรากระษาณ์เป็นครั้งแรก

พระองค์เจ้ารัชนีจึงได้รับมอบหมายให้จัดตั้งระเบียบราชการกรมใหม่นั้น ได้ทรงเป็นแม่กองปรึกษาในการคิดแบบลวดลายและสีของธนบัตรแต่ละชนิด ทรงมีส่วนในการตราพระราชบัญญัติเงินตรา วางกฎเสนาบดีในการควบคุมธนบัตร และทรงวางหลักการบัญชีด้วย ธนบัตรที่จัดทำขึ้นครั้งนั้นมีอัตราใบละ 1,000 บาท 100 บาท 20 บาท 5 บาท ส่วนอัตรา 1บาทยังคงใช้เหรียญตรากระษาณ์อย่างเดิม และได้นำธนบัตรออกจำหน่ายเป็นปฐมฤกษ์เมื่อวันเปิดกรมธนบัตรหลังจากนั้น ได้ทรงเลื่อนตำแหน่งขึ้นเป็นผู้แทนเจ้ากรมธนบัตร เมื่อวันที่ 1 เมษายน พ.ศ. 2446 และทรงย้ายไปเป็นเจ้ากรมกองที่ปรึกษาอีกครั้งหนึ่ง เมื่อวันที่ 1 กันยายน พ.ศ. 2446 เสด็จอยู่ในตำแหน่งได้ 14 เดือน ก็ต้องทรงย้ายไปรับราชการในตำแหน่งอธิบดีกรมกระษาปณ์สิทธิการ

ในวันที่ 1 กันยายน พ.ศ. 2458

ทรงพระกรุณาโปรดเกล้าฯ ให้ยกกรมสถิติพยากรณ์ขึ้นเป็นกรมบัญชาการ ชั้นมีอธิบดีเป็นหัวหน้า อยู่ในสังกัดกระทรวงพระคลังมหาสมบัติ มีชื่อว่า "กรมพาณิชย์และสถิติพยากรณ์" จึงทรงพระกรุณาโปรดเกล้าฯ ให้พระราชวรวงศ์เธอกรมหมื่นพิทยาลงกรณ์ เป็นอธิบดีพระองค์ได้ทรงริเริ่ม จัดงานสำคัญขึ้นแผนกหนึ่ง ด้วยทรงคำนึงว่าชาวนาเป็นส่วนหนึ่ง ของการพาณิชย์ เพราะข้าวเป็นสินค้าสำคัญของประเทศ แต่ขณะเดียวกันชาวนากลังมีหนี้สินมากทำนาได้ข้าวเท่าใดก็ต้องขาย ใช้หนี้เกือบหมด แต่หนี้สินก็ยิ่งพอกพูน จากการหาแนวทางต่างๆ เพื่อทำการช่วยเหลือ ผลโดยสรุปเห็นว่าวิธีการที่จะช่วยเหลือชาวนา ให้พ้นจากอุปสรรคดังกล่าวได้ ต้องดำเนินการโดยใช้วิธีจัดตั้งสหกรณ์

เมื่อมีการเปลี่ยนแปลงการปกครอง พ.ศ. 2475 สมเด็จพระเจ้าบรมวงศ์เธอ กรมพระยาดำรงราชานุภาพ สภานายกแห่งราชบัณฑิตสภาเสด็จ แปรพระสถานจากกรุงเทฯ ไปประทับแรมเป็นประจำอยู่ที่หัวหิน จังหวัดประจวบคีรีขันธ์ พระราชวรวงศ์เธอกรมหมื่นพิทยาลงกรณ ผู้แทนเป็นอุปนายกแผนกวรรณคดีแห่งราชบัณฑิตยสภา จึงทรงเป็นสภานายกแทน ได้ทรงปฏิบัติราชการทุกแผนกในราชบัณฑิต ดำเนินรายตามระเบียบเดิม ซึ่งสภานายกพระองค์ก่อนทรงจัดไว้โดยตลอด

จนกระทั่ง พ.ศ. 2476

เมื่อคราวที่จัดระเบียบงานขึ้นใหม่ ได้เปลี่ยนนามราชบัณฑิตสภาเป็น "ราชบัณฑิตยสถาน" กรมหมื่นพิทยาลงกรณ จึงได้กราบถวายบังคมลาออก ทรงรับพระราชทานบำนาญพระราชวรวงศ์เธอ กรมหมื่นพิทยาลงกรณ ได้ทรงนิพนธ์งานเขียนไว้มากมายทั้งร้อยแก้วและร้อยกรอง ทรงใช้นามปากกาว่า "น.ม.ส." ซึ่งมาจากพระนามเดิมของพระองค์นั่นเอง โดยทรงหยิบเอาอักษรตัวท้ายของพระนามแต่ละคำที่ผสมกันอยู่ออก มาเป็นคำย่อ (รัชนีแจ่มจรัส) ผงงานนิพนธ์ของพระองค์ท่าน เช่น เรื่องของนักเรียนเมืองอังกฤษ สงครามรัสเซียกับญี่ปุ่น สืบราชสมบัติ พระนลคำฉันท์ ตลาดเงินตรา นิทานเวตาล กนกนคร กาพย์ เห่เรือ ฉันท์สดุดีสังเวยสมโภชพระมหาเศวตฉัตร ความนึกในฤดูหนาว และสามกรุง ฯลฯ

เมื่อ พ.ศ. 2429

ได้เสด็จเข้าเป็นนักเรียนประจำ ณ โรงเรียนพระตำหนักสวนกุหลาบ เสด็จกลับวังเฉพาะวันพระ ทรงเรียนอยู่เพียงปีเศษจกการันต์ คือ จบสูงสุดในประโยค 1 และในระหว่างนั้นทรงเรียนภาษาอังกฤษ ควบคู่ไปด้วย ทรงเรียนจบประโยค 2 เมื่อ พ.ศ. 2434 ทรงสอบไล่ได้เป็นที่ 1 ได้รับพระราชทานหีบหนังสือเป็นรางวัล จากนั้นได้เรียนภาษาอังกฤษ ต่อไปจนจบหลักสูตรการเรียนของโรงเรียนสวนกุหลาบ เมื่อทรงสำเร็จวิชาการโรงเรียนสวนกุหลาบแล้ว พระชันษายังน้อยเกิน กว่าที่จะรับราชการ จึงเสร็จเข้าเรียนภาษาอังกฤษต่อที่สำนักอื่นแห่งหนึ่ง

เมื่อวันที่ 1 สิงหาคม 2439

ในที่สุดพระองค์ท่านก็กลายเป็นผู้ถูกอัธยาศัยอย่างมากกับที่ปรึกษา กระทรวงพระคลังมหาสมบัติ ซึ่งเป็นชาวอังกฤษ จนที่ปรึกษาถึงกับทูลปรารภต่อเสนาบดีว่า "ควรส่งคนหนุ่มอย่างพระองค์ท่านไปศึกษาที่ ประเทศอังกฤษเสียพักหนึ่ง ก็จะได้คนดีที่สามารถใช้ราชการในวันข้างหน้า"

ในวันที่ 1 เมษายน พ.ศ. 2440

จึงทรงย้ายมารับตำแหน่งเป็นล่ามที่กระทรวงพระคลังและได้ทรง พระกรุณาโปรดเกล้าฯ ให้ตามเสด็จพระราชดำเนินประพาสทวีปยุโรป เมื่อวันที่ 7 เมษายนปีนั้น และได้รับพระราชทานพระบรมราชานุญาติ ให้ทรงเล่าเรียนต่อในประเทศอังกฤษ ผู้ดูแลนักเรียนหลวงจัดให้ท่าน ไปเรียนอยู่กับแฟมิลี่ คือครูของท่านซึ่งเป็นพระสำเร็จการศึกษา จากมหาวิทยาลัยเคมบริดจ์ ทรงเรียนอยู่กับแฟมิลี่ได้เพียง 6 เดือน ก็ทรงสอบคอเลชออฟพรีเซ็บเตอร์ ภาค 1 ได้ และ

ด้วยความวิริยะอุตสาหะและตั้งพระทัยอย่างแน่วแน่ ทำให้สามารถสอบเข้า มหาวิทยาลัยเคมบริดจ์ได้ ระหว่างศึกษาทรงหาความรู้ใส่พระองค์ อย่างที่ทรงใช้คำว่า "บรรทุก" ทรงโปรดกีฬาจนเป็นพระนิสัย และทรงเล่นกีฬาอย่างเต็มที่ทำให้พระองค์ทรงกว้างขวางในสังคม มหาวิทยาลัยแต่ทรงศึกษาได้เพียง 3 เทอม ก็ถูกเรียกตัวกลับประเทศ

จนกระทั่ง1 เมษายน พ.ศ. 2451

ได้ทรงเลื่อนขั้นเป็นอธิบดีกรมตรวจแลกรมสารบัญชี ซึ่งเป็นกรมใหญ่และสำคัญกรมหนึ่งในกระทรวงพระคลังมหาสมบัติ (ภายหลังกรมตรวจแลกรมสารบัญชี เปลี่ยนชื่อเป็นกรมบัญชีกลาง) ทรงดำรงตำแหน่งจนสิ้นรัชกาลที่ 5 รวมเวลาที่พระองค์เจ้ารัชนีแจ่มจรัสทรงรับราชการในรัชกาลที่ 5 เป็นเวลา 17 ปี จนมีพระชันษาได้ 33 ปี

พ.ศ. 2454

พระบาทสมเด็จพระมงกุฎเกล้าเจ้าอยู่หัวทรงพระกรุณาโปรดเกล้าฯ ตั้งให้เป็นองคมนตรี ได้ทรงรับพระราชทานสัญญาบัติองคมนตรี เป็นลำดับที่ 19 ในองคมนตรีทั้งสิ้นรวม 233 ท่าน

พ.ศ. 2456

ได้รับพระกรุณาโปรดเกล้าฯ ให้เฉลิมพระยศเป็นพระองค์เจ้าต่างกรม มีพระนามจาฤกในพระสุพรรณบัฎว่า พระราชวรวงศ์เธอกรมหมื่นพิทยาลงกรณ์ ทรงศักดินา 11,000 ไร่ ตามพระราชกำหนดอย่างพระองค์เจ้า ต่างกรมในพระราชวังบวร

กรมพาณิชย์และสถิติพยากรณ์ ได้ขยายงานกว้างขวางไปหลายแผนก และมีพระบรมราชโองการโปรดเกล้า ประกาศแต่งตั้งกรมพาณิชย์ และ สถิติพยากรณ์ ขึ้นเป็นกระทรวงพาณิชย์ เมื่อวันที่ 20 สิงหาคม พ.ศ. 2463 ให้อยู่ในความคบคุมของสภาเผยแพร่พาณิชย์ และได้ทรงพระกรุณา โปรดเกล้าฯ แต่งตั้งให้ พระราชวรวงศ์เธอ กรมหมื่นพิทยาลงกรณ์ เป็นอุปนายกแห่งสภานั้น จนกระทั้ง พ.ศ. 2464 ได้มีพระบรมราชโองการโปรดเกล้าฯ ตั้งให้พระราชวรวงศ์เธอกรมหมื่น พิทยาลงกรณ์เป็นรองเสนาบดีกระทรวงพาณิชย์ (ทรงมีตำแหน่งในที่ประชุมเสนาบดีสภาตั้งแต่ พ.ศ. 2463 จนถึงเดือนพฤศจิกายน พ.ศ. 2468 อันเป็นการประชุมเสนาบดีครั้งสุดท้ายในรัชกาลที่ 6)